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MCE主题直播|细胞凋亡：机制、标志物与检测方法的解决方案
讲师：竺玲 MCE高级生物技术支持
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直播内容
细胞凋亡 (Apoptosis)，亦称程序性细胞死亡，是细胞发生的有序的、既定的自我毁灭过程，其失调与癌症、神经退行性疾病等多种疾病密切相关。本次直播，小 M 将带领大家了解常见的细胞凋亡标志物及检测方法、探索细胞凋亡的激活剂、抑制剂及相关化合物库，助力您了解疾病的发病机制、寻找新的治疗靶点和策略。

本次直播将为您带来：

1.深入解析细胞凋亡机制

2.全面介绍经典检测技术

3.探讨激活剂和抑制剂的应用

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主题讲座
细胞凋亡 Apoptosis 细胞凋亡标志物及检测方法
微课堂
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直播答疑
Q：

JC-1 一直染不出来是什么原因？

A：
建议增加阳性对照 (CCCP) , 对于大多数细胞，经 CCCP 处理后，线粒体膜电位会完全丧失, 增加阳性对照可以排除实验操作和 JC-1 的问题。
Q：

这些 caspase 的抑制剂是通用的吗？

A：
首先要确定你的样本中 （细胞或者组织）是否有表达这个caspase蛋白，然后最后参考下文献中的处理浓度和时间，看文献中有没有相同的模型。
Q：

有的细胞凋亡抑制剂加多了或者处理时间长了本身也会导致细胞死亡，这种怎么避免?

A：
一般来说，细胞凋亡抑制剂可以抑制细胞内发生的、导致细胞代谢紊乱凋亡，但加多了或者处理时间长可能会对细胞产生非特异性毒性、细胞代谢紊乱、激活其他细胞死亡通路（如坏死性凋亡、自噬等），导致细胞死亡等。建议您多查阅文献，并设置浓度梯度实验和时间梯度，选用文献报道的凋亡特异性抑制剂，以减少对其他细胞生理过程的干扰，并注意观察细胞的形态、增殖和存活情况，确定最佳实验条件。
Q：

众多细胞检测凋亡的方式，该选哪一个呢？为什么选电镜比较少，选 Western blot 的比较多？

A：
检测细胞凋亡的方法有很多种,选择哪种方法需要考虑实验目的、样品类型、检测灵敏度、特异性、操作难度等因素。

1.电子显微镜 (TEM) 的优势在于可以观察到细胞凋亡的典型形态学变化,如染色质凝聚、细胞质缩小、细胞膜皱缩等，以及细胞的超微结构，但需要专业设备和技术,操作复杂,样品制备耗时。TEM 通常用于研究凋亡的形态学特征和机制,不适合大规模样品检测。

2.常见的检测方法是先用 Annexin V/PI 等方法进行初步验证,再用 Western blot 等方法验证关键蛋白的表达，Western blot 操作相对简单,可定量分析。

Q：

MCE 细胞凋亡化合物库不用自己找药，只需要提供靶点通路你们帮忙找药吗？怎么筛选的少一点? 两千多个太多了。

A：
MCE 细胞凋亡化合物库（HY-L003）收录了 2,400+ 种凋亡相关产品，主要靶向凋亡信号通路种主要靶点，可以用于细胞凋亡信号通路及相关疾病的研究。

1.如果您需要某些靶点或者通路的化合物，MCE 可根据您的需求进行匹配，定制您需要的化合物库。另外，我们也提供一站式药筛服务。

2.如果您想筛选的少一点，不需要两千多个，这个也是可以根据您的需求定制的，比如，有些客户只想做老药，那就可以保留 FDA 的，只想做新药，那就只要还没上临床的，比如想要其中的代谢物或者天然产物等等，需要根据您的需求来定制。

Q：

通过抑制 P53 去抑制凋亡通路有什么可用的抑制剂吗？

A：
有文献表明，p53 可通过不同的途径诱导细胞周期停滞和凋亡 (PMID: 29149101)，抑制 p53 的研究主要集中在小分子抑制剂（如 PFT-α）和 RNA 干扰技术。 PFT-α (HY-15484) 是一种小分子抑制剂，能够特异性抑制 p53 的活性。它通过与 p53 结合，阻止其转录激活功能，从而减少 p53 依赖的凋亡。在多种细胞模型中，PFT-α 被证明可以降低因化疗药物引起的细胞死亡。此外，使用小干扰 RNA (siRNA) 或反义寡核苷酸 (ASO) 来特异性降低 p53 的表达，从而抑制其介导的凋亡。
Q：

血小板凋亡检测可以用哪种方式？

A：
血小板的凋亡标志物包括线粒体内膜膜电位 (Δφm) 的去极化、细胞色素 c 的释放、促凋亡和抗凋亡蛋白 Bcl-2 家族的表达含量变化、Caspase-3 的激活、磷脂酰丝氨酸 (PS) 的暴露、血小板收缩、碎裂成微粒、血小板表面的水泡和丝状足挤压等 (PMID: 22383127)。常用的检测方法包括流式细胞术、Western blot 分析和电子显微镜 (TEM)，是检查各种生理和病理环境中血小板凋亡的有用工具。
Q：

细胞凋亡和细胞坏死能够同时存在吗？

A：
细胞凋亡和细胞坏死能够同时存在。 细胞死亡是一个复杂的生物学现象，细胞凋亡和细胞坏死是两种不同的细胞死亡方式，细胞在不同的刺激下可能会经历不同的死亡途径。但细胞凋亡和细胞坏死也有共同存在的机制。

1.在某些情况下，细胞可能同时经历凋亡和坏死。例如，在严重的氧化应激或细胞损伤下，细胞可能首先激活凋亡通路，但由于损伤过于严重或时间过长，最终转变为坏死 (PMID: 11035261)。

2.细胞凋亡和坏死的信号通路之间存在交叉。例如，在炎症性疾病中，某些炎症因子或细胞因子可以同时激活凋亡和坏死的相关信号通路 (PMID: 11997180)。

3.在某些疾病 (如肿瘤、神经退行性疾病等) 中，细胞凋亡和坏死也有可能同时发生，影响疾病的进展和治疗效果。

Q：

Annexin V/PI 双染的流式细胞术中,四个象限的细胞分别代表什么状态？

A：
左上象限 Q1：Annexin V-/PI+，一般是机械损伤的细胞，如果这个象限的细胞特别多，需要排除实验操作异常。

右上象限 Q2：Annexin V+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞和坏死细胞。

右下象限 Q3：Annexin V+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。

左下象限 Q4：Annexin V-/PI-，此区域的细胞为活细胞。

Q：

衰老细胞线粒体膜通透性也会发生改变，检测膜电位能区分凋亡和衰老吗？

A：
膜电位变化并不是凋亡或衰老的唯一指标，建议结合其他检测方法和生物标志物的分析 (如 Annexin V/PI 染色、Caspase 活性检测、活性氧水平/β-gal 活性检测等) 有助于更准确地评估细胞的生理状态。
Q：

凋亡的荧光检测方法中，流式细胞术和荧光显微镜检测哪个结果更准确一些呢？

A：
在凋亡检测中，流式细胞术和荧光显微镜检测各有特点。

流式细胞术

可实现高通量分析，定量分析荧光强度，可实现对不同细胞群体的分析。但样本处理相对复杂，可能导致细胞损失或结果偏差。

荧光显微镜

可以通过荧光显微镜观察细胞形态变化，提供形态学信息，操作简单，适合小规模实验。但通常只能分析有限数量的细胞，结果的统计学意义较低，通常用于定性，难以进行准确的定量分析。

Q：

确定凋亡的发生后是否有必要确定是内源或者外源的？

A：
在某些情况下是必要的，确定是内源性还是外源性的有助于研究细胞发生凋亡的具体机制，有助于药物发现的研究。 例如，确定抗癌药物诱导癌细胞凋亡的确切途径可以明确抗癌机制，对临床上的用药具有一定的指导意义 (PMID: 33879127)。此外，凋亡的失调会导致疾病的发生，确定凋亡的具体机制有助于研究疾病的发病机制，助力药物开发。比如，Fas 信号通路缺陷的 Lpr 和 gld 小鼠会出现淋巴结肿大和脾肿大，并发展出一种类似于人类系统性红斑狼疮 (SLE) 的疾病，表明外源性凋亡通路在自身免疫病研究中发挥着重要作用 (PMID: 22683550)。
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